骨髓間充質干細胞BMSCs培養/誘導分化/成骨成脂誘導威斯騰生物

骨髓間充質干細胞BMSCs培養/誘導分化/成骨成脂誘導

骨髓間充質干細胞（BMSCs）培養

實驗動物

4 周齡SD大鼠

主要試劑及儀器

DMEM/ F12培養基、胎牛血清和胰酶均購自美國Gibico 公司，CO2恒溫培養箱購自美國Thermo公司。

步驟

a． 取SD大鼠，頸椎脫臼法處死后立即用75%乙醇浸泡，移入超凈工作臺內，用大頭針固定大鼠四肢于工作臺面的泡沫板上。

b． ***酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，無菌條件下用滅菌消毒后的鑷子和剪刀分離出大鼠股骨和脛骨,剔除骨頭表面肌肉，PBS溶液沖洗兩遍。

c． 從中折斷骨頭，用2ml無菌注射器吸取PBS溶液沖出骨髓細胞多次，再用針頭吹打，吸管吸入離心管內，1000r/min離心5min，棄上清。

d． 用含10%胎牛血清及青鏈霉素的DMEM/F12 重懸細胞，接種于無菌培養瓶，置37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。

e． 24小時后棄去培養液，PBS沖洗 2~ 3次去除未貼壁細胞，加入培養液繼續培養。以后每2~ 3d換液1次，7~ 10d細胞生長融合，經0.25%胰酶消化，1~2傳代，其后一般3d傳代1次，選取生長良好的第三代細胞進行后續實驗。

鑒定

胰酶消化P3代細胞，PBS洗滌2次，分別加入PE標記CD29、CD34、CD45、CD90單克隆熒光抗體，并設同型對照，室溫避光孵育，應用流式細胞儀檢測BMSCs的表面標志。

細胞形態

BMSCs原代培養過程中，約24小時即可出現貼壁生長,細胞呈圓形、梭形、三角形生長緩慢。換液后細胞增殖明顯,出現以梭形為主的多種形態，10~14天70% ~80 %可融合達到傳代標準。傳代細胞形態單一，呈梭形或扁平型，增殖至細胞融合時呈漩渦狀和***狀排列。

骨髓間充質干細胞誘導分化

（1）收集細胞：在顯微鏡下觀察培養瓶貼壁面至70%-80%融合，在超凈工作臺上操作，先吸除培養瓶中舊培養基，用PBS洗2~3次，50mL培養瓶加入胰酶消化液約1-3mL，按此比例進行消化，晃動使消化液鋪均勻，置37度培養箱約2-5min，鏡下見細胞收縮變圓或少數脫落后，輕輕振動瓶底使細胞全部脫落，加入2-3mL完全培養基后，輕輕吹打，收集細胞至離心管，1 000 rpm離心5 min棄上清，加培養液，輕輕吹打成細胞懸液。

（2）細胞接種：將上述細胞懸液接種于無菌的6孔細胞培養板，加入2mL完全培養基，放入CO2培養箱 37℃培養 。

（3）細胞誘導：待細胞至50%-60%融合時，加入含50ug/lVEGF、10ug/lFGF、10%FBS的誘導培養液，放入CO2培養箱 37℃培養，連續誘導培養21d,每隔2天換液，每周傳代1次。

血管形成實驗

(1) 將Matrigel放于4℃融化（不能放于室溫，凝固之 后不可以再用）。滅菌的100μL槍頭，24孔板冷藏備用；

(2) 開始實驗時，從冰箱中取出冷藏的槍頭和24孔板，在24孔板每個孔中加入150μL Matrigel。加入膠時注意保持槍頭垂直于孔中間位置，Matrigel一直保持放在冰上；

(3) 加入膠后，將整個培養板放入培養箱中，放置30min使凝膠凝固；

(4) 取經不同濃度藥物A處理的不同代次的主動脈內皮細胞，消化后用無血清的培養基調整細胞濃度到2×105 cell/mL；

(5) 從培養箱中取出24孔板，每孔加入200μL細胞懸液；

(6) 蓋上蓋子后放入培養箱培養；

(7) 24h內記錄細胞變化。

人間充質干細胞hMSC成骨誘導

待細胞長至基本融合后，制備完成的成骨誘導培養液（基礎培養液+0.1μmol/L***+ 50μg/mL抗壞血酸+ 10 mmol/L β - 甘油***酸鈉），每隔一天換液一次，誘導21天后再進行礦化結節的茜素紅染色。

茜素紅染色： 

1、誘導后細胞爬片用PBS漂洗2x2min；

2、4%多聚甲醛處理（室溫）20min；

3、PBS漂洗，3x2min；

4、茜素紅染液染30min；

5、雙蒸水沖洗2次；

6、干燥，封片。

3T3-L1脂肪細胞誘導分化成脂肪細胞

3T3-L1細胞融合至約70%時，用0.25%胰蛋白酶消化，傳代至6孔培養板中，待細胞接觸抑制2d后(誘導分化第0d) ，用經典***雞尾酒誘導方案誘導前脂肪細胞分化，加入分化誘導培養基1（0.5 mmol/L IBMX，1 μmol/L DEX、10ug/mL INS），72h后撤去IBMX和DEX，完全培養基中僅含有INS（誘導培養2），繼續培養3d后，僅含有10% FBS，2d換液1次，誘導分化8~10d。

注意事項：

1) 待細胞接觸抑制后2d加入誘導劑。太早，細胞沒有退出生長周期。太遲，細胞誘導后容易漂浮。 

2) 3T3細胞株20代以后分化困難，最好挑選5代左右開始誘導分化。將細胞凍存起來，使用時再復蘇。 

3) 大約需要8~10天，可以誘導分化成功。之后換液處理需要輕緩，以免損失細胞。

細胞細胞形態學觀察

倒置顯微鏡下觀察分化前3T3-L1前脂肪細胞呈梭形，胞漿內無脂滴，分化后3T3-L1前脂細胞呈圓形，胞漿內含有大量的脂滴。

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