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植物經常在根際中招募微生物以改善其適應性，同時應對非生物脅迫。叢枝菌根（AM）真菌與大多數陸地植物形成互利共生關系，并提高寄主植物對不利環境的適應力。棗是一種典型的AM共生木本物種，已知其AM根在野外條件下廣泛發育。然而，它們對鹽脅迫的適應仍然未知。2022年5月，西北農林科技大學黃建課題組在Plant Physiology（IF 8.005）上發表 “Mycorrhizal symbiosis reprograms ion fluxes and fatty acid metabolism in wild jujube during salt stress”的研究文章，作者利用靶向代謝組學和轉錄組學揭示了AM促進棗對抗鹽脅迫的機制，提示了AM提高共生宿主離子穩態和調控宿主脂肪酸（FA）代謝以對抗鹽脅迫的新方向。中科新生命參與了該研究中靶向代謝組（植物激素、脂肪酸）檢測的相關工作。 研究材料野生型根瘤菌接種與非菌根（NM）野生棗幼苗 、K+攝取缺陷的酵母突變菌株 技術路線步驟1：觀察AM共生對鹽處理的生理反應；步驟2：分析鹽脅迫下AM共生對宿主離子通量及離子穩態的影響；步驟3：靶向代謝分析AM共生調控宿主的植物激素水平和FA含量；步驟4：轉錄組解析AM共生影響宿主的轉錄調控；步驟5：分析鹽脅迫和AM共生對宿主離子通道/轉運及FA相關基因的調控。研究結果1. AM提高宿主幼苗的耐鹽性結果顯示，相比于NM，AM共生情況下幼苗的鹽脅迫效應更弱。此外發現，AM共生顯著提高了鹽脅迫下宿主的生物量、凈光合速率和抗氧化系統。圖1 AM共生對鹽處理的生理反應 2. AM共生促進鹽脅迫下的離子穩態和根尖離子通量鹽脅迫下AM和NM幼苗均積累了更高濃度的Na+，然而相較于NM，AM共生促進了幼苗在鹽脅迫下的K+的積累量，進而保持了較高的K+/Na+比值。AM共生同時也促進了幼苗磷水平的提高。因此，AM共生增加了宿主對鹽脅迫的適應，主要是通過增強磷和鉀的獲得來促成的。此外，通量變化結果顯示，鹽脅迫下AM共生提高了H+和Ca2+的外排、降低了K+的外排。這些結果提供了AM共生維持K+ / Na+的證據。圖2 AM共生改變宿主離子通量 3. AM提高共生植物的生長激素與FA含量植物激素有助于協調植物對不利條件的反應，也是菌根建立和功能發揮的介質。為了研究鹽脅迫下AM共生對植物激素水平的調控，作者使用靶向代謝組對AM/NM幼苗的葉片和根部進行分析。AM共生誘導了以下顯著影響：在鹽脅迫期間，AM幼苗葉片吲哚-3-乙酸（IAA）增加、根部IAA降低；鹽處理使AM根部的脫落酸(ABA)顯著升高；鹽脅迫顯著提高了AM植株葉片中水楊酸（SA）、反式玉米素(tZ)、異戊烯腺嘌呤(iP)和異戊烯腺苷核苷(iPR)的含量。在菌根互惠共生關系中，宿主植物主要以FA為主要碳源的形式提供給共生真菌，AM共生對宿主植物根系的FA代謝和轉運過程進行了廣泛的調控。靶向代謝組結果表明，發現AM共生同時提高了幼苗根系和葉片的FA含量，尤其是棕櫚酸（C16:0）、油酸（C18:1N9）、反式油酸（C18:1TN9）、亞油酸（C18:2N6）。類似的結果在楊樹和苜蓿中得到證實，表明AM共生提升了葉子和根部的FA，這是AM植物的保守生理效應。圖3 靶向代謝組分析AM共生調節宿主激素和FA水平 4. 轉錄組發現與AM共生相關基因為了進一步研究AM共生促進宿主抗鹽的機制，作者對AM/NM幼苗的葉片和根系進行了轉錄組分析。加權基因共表達網絡分析（WGCNA）分析結果的模塊-性狀關系證明了清晰的組織效應和AM效應。其中有兩個模塊在鹽脅迫下與AM共生幼苗的根系特異性相關。KEGG富集分析表明上述兩個模塊主要參與了FA代謝和生物合成、生物素代謝、植物激素信號轉導、SNARE相互作用和甘油磷脂代謝途徑，高度對應于AM共生。圖4脅迫下NM和AM幼苗的WGCNA 5. 離子通道/轉運蛋白受鹽脅迫和AM共生調控轉錄組結果顯示，AM共生顯著提高磷轉運相關基因（ZjPHT1）、K+轉運蛋白（ZjHAK2）基因、Shaker類K+通道蛋白（SKORs）基因、質膜型ATP酶（ZjAHA7）的表達。這些結果證明AM共生通過激活了質膜型ATP酶來增強H+的外排，同時與ZjHAK2表達協調以促進K+的流入。這些K+轉運/通道蛋白共同調節AM宿主的離子穩態，同時應對鹽脅迫。該實驗中，作者K+吸收缺陷型酵母菌株R5421證明了ZjHAK2具有K+ 轉運活性。圖5 ZjHAK2在酵母中的系統發育分析及功能鑒定6. FA代謝相關基因受鹽脅迫和AM共生調控接下來，作者鑒定了所有參與FA生物合成和運輸的潛在基因。在FAs循環中，ZjACP2、ZjKASI2、ZjENR1和ZjKAR2強上調，并特異性誘導ZjACP4表達。這些結果表明，AM共生極大地增強了FAS循環的活性。同樣，FA伸長和加工途徑、FA運輸途徑相關基因的表達在AM共生宿主中同樣被上調。所有上述結果證明FA代謝在AM共生中被顯著重編程。RT-qPCR驗證部分關鍵基因轉錄組結果的準確性。圖6 鹽處理過程中AM和NM幼苗FA生物合成、加工和運輸的基因表達譜 小結該研究為菌根共生提高木本植物對鹽脅迫的適應性提供了一個全面的認識，闡明了AM共生提高宿主植物離子穩態的機制，發現了AM共生調控宿主植物脂肪酸代謝的新效應。 中科優品推薦【中科新生命】建立了完整的代謝組學服務平臺，其中靶向代謝組系列產品包含15+kit，高覆蓋常見類型物質，全標準品開發，精確定性，精準定量。目前多款產品持續火熱促銷中，歡迎感興趣的老師前來咨詢。...
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早在1976年，德國科學家Frieden Stein和他的同事在骨髓中發現了間充質干細胞（MSCs），后來的研究者發現間充質干細胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC)是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞，在特定的誘導條件下，能夠分化成不同類型的細胞，包括成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、肌細胞、神經細胞等，而且沒有醫學倫理的困擾，所以受到科學家的青睞，被廣泛應用于組織再生、器官修復、血液病、癌癥治療等領域。MSC的體外培養擴增不可避免地經歷復制性衰老，伴隨著基因組不穩定性，這是MSC細胞治療行業一個嚴重的障礙。此外，因為接種起始MSC細胞濃度不一樣，即使經過相同的擴增代數，細胞的復制周期是不一致的，導致批次間生產的MSC細胞的穩定性差，這也是目前MSC細胞在治療行業的一個瓶頸。 因此通過單一MSC細胞來源的穩定細胞株為提供可持續的、穩定的MSC細胞生產成為關鍵，可以助力MSC干細胞治療行業的快速發展。為什么要挑選MSC細胞的單克隆細胞株？細胞單克隆性，一般指用于建立最初的種子庫細胞為單個細胞來源。藥物生產過程中，具有單克隆源性的細胞庫能夠更好地保持產品批次之間的質量一致性，因此在三級細胞庫建立過程中細胞的來源一致性尤為重要；這一點也是預防種子庫細胞變異的風險的關鍵，也可更好的對上游工藝開發和下游產品質量的把控。相反的，多克隆細胞系構建成功后不同細胞克隆生長速度不一致，目的基因表達量比較低的細胞克隆增殖速度一般更快，因此在最初的10代左右會觀察到表達量逐漸下降，且不能長期維持細胞表型�？紤]到產品安全性，FDA的政策和法規都要求生物制藥企業提供清晰圖片證據，用以證明生產用的細胞株的單克隆源性。本文詳細介紹了利用Cytena公司開發的單細胞打印技術(SCP technology)，通過將單個的MSC細胞自動分離到標準的96/384孔板中，大大加速MSC單克隆細胞株的開發。材料與方法1、細胞類型：貼壁的間充質干細胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC）。2、樣品處理方法：1) 用胰酶消化處理MSC細胞，變成懸浮細胞；2) 用biosharp DMEM低糖培養基清洗重懸細胞，用40 μm的篩網過濾樣品，去除細胞團塊；3) 按照7E5cells/ml的密度，將細胞加入一次性的分選芯片中。3、分選工具：德國Cytena單細胞打印機F.SIGHT 2.0和一次性Catridge圖1：克隆篩選單細胞打印系統分選流程圖（single-cell printer™，scp™） 結果表1是通過SCPTM和手動-LD方法分選的多塊96孔細胞培養板的統計結果，我們可以發現SCPTM分選的D0單細胞率是手動-LD的4倍，在培養15天后統計“單克隆率”發現是手動-LD的3.67倍之多(表2)！表1：MSC細胞單細胞率統計表由于MSC細胞是貼壁細胞，細胞的結團率比較高，所以MSC的單細胞率不像懸浮類細胞的高（CHO單細胞率可以達95%以上），但是相比于平行的有限稀釋法來說，單細胞率也提高了近4倍，提高了單克隆的篩選效率。表2：MSC細胞單克隆率統計表采用一次性的專利的微流控芯片進行單細胞分選，每次只產生約150pL的液滴，單細胞率高。無菌的一次性的芯片可以避免項目之間的交叉污染，設備無需清洗和驗證，有利于日后項目的申報審批。圖2：微流控專利Cartridge芯片（150pL/單液滴體積）討論單細胞率是決定單克隆率高低的關鍵性因素，因此為尋求最適MSC貼壁樣品篩選條件，我們做了以下測試：板A1-3篩選圓度范圍為0.5-1，板A4縮小圓度范圍為0.7-1，直徑范圍均為15-25μm。表1中“手工-LD”部分結果包括多克隆團，因此表2中 LD方法“D15單克隆率 Cytena克隆篩選單細胞打印系統（single-cell printer™，scp™）采用專利的芯片，能溫和、高效、快速的分選，既保證了D0高的單細胞率，又結合了高分辨率的光學系統，留下單細胞分選的“印跡”，通過設置細胞的直徑、細胞圓度、細胞熒光強度等質控方式，分選出“強壯”的細胞，利于后期克隆恢復，獲得高的單克隆率。結論SCPTM所獲得貼壁的MSC單克隆率是手工-LD的3.67倍多！分選條件設置為：圓度范圍在0.5-1，直徑范圍在15-25μm，更適合于MSC樣品的單細胞篩選！這也說明了SCPTM可以很好的應用于MSC單克隆細胞株的篩選，助力于MSC細胞在細胞治療、基因治療、組織工程以及再生醫學等領域的發展！...
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